背景介绍

裸露的RNA是一种带负电荷的亲水性大分子，由于细胞膜的静电排斥，RNA难以进入细胞，且容易遭到RNA酶的快速降解。因此，RNAs需要一个保护性外壳才能顺利进入细胞。细胞膜主要由脂质组成，因此可以利用脂质囊泡来包裹RNA，从而帮助其穿过细胞膜并有效释放到细胞质中。该囊泡通常是带正电的脂质，以便可以与带负电的RNA结合。然而，由于含有永久阳离子脂质的囊泡可能与带负电的细胞膜发生静电作用，从而产生细胞毒性，因此其脂质结构需要能够对内体酸性环境做出响应，以确保分子在细胞内的正常功能。

脂质纳米粒结构

脂质纳米粒（LNP）通常由以下四种关键成分组成：可离子化的阳离子脂质、磷脂（两性离子脂质）、胆固醇和PEG化脂质。LNP作为mRNA的传递系统，其作用机制涉及多个步骤，以确保mRNA安全有效地递送到目标细胞并表达所需蛋白。在LNP中，阳离子脂质的可电离性是关键，因为它能带正电降低其Ka，以便在自组装成LNP期间有效负载带负电荷的RNA，保持在中性pH下以减少毒性，并在细胞吸收后再次带正电以促进内体逃逸，随着内体pH的降低。此外，胆固醇和PEG脂质变体已被证明可以调节LNP的物理性质、纳米结构和最终效能。两性离子磷脂通常也被称为“辅助脂质”。LNP在保护mRNA、促进细胞内部转运及激活免疫反应方面发挥着重要作用。

LNP转染实验步骤

下述转染步骤以6孔板的单孔参考条件为例。对于其他培养形式，请参阅表1。

1. mRNA预混液制备

将25μg mRNA（浓度为1μg/μL）与60μL Buffer混合。

2. mRNA-easyLNP复合物制备

将625μL mRNA预混液与625μL easyLNP纳米混悬液混合，涡旋2-3秒以充分混匀。

3. 加入细胞

将125μL mRNA-easyLNP复合物加入细胞中，轻轻晃动以确保均匀分散。

4. 分析时间

培养24-48小时后进行分析。

mRNA转染指南

细胞培养容器	mRNA转染步骤
96孔板	40ng/μL mRNA预混液制备
24孔板	12μL Buffer + 5μg mRNA
6孔板	60μL Buffer + 25μg mRNA

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