细胞冻存是一种用于在低温条件下保存细胞的有效技术，其主要目标是维持细胞的活性和功能，以便在长期保存、实验的重复性、基因库的建立以及细胞治疗的储备等方面发挥重要作用。通过冻存，研究人员可以显著减少细胞在传代过程中的遗传变异，避免因污染、环境变化或实验操作失误而导致的细胞损失。最佳的冷冻保存时机是细胞处于最佳生长状态之时。

冷冻保护剂是细胞冻存过程中不可或缺的成分，常用的冷冻保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油。这些保护剂的主要功能在于降低溶液的冰点，减少冰晶的形成，从而有效保护细胞免受冰晶带来的机械损伤。虽然DMSO是一种广泛适用的冷冻保护剂，但某些细胞类型对其敏感，此时甘油可以作为替代品。

第1阶段：冷冻保存

918博天娱乐官网提示实验步骤如下：

1. 在冷冻管上标记日期、研究人员姓名、细胞编号、传代数及细胞类型等有用信息。

2. 如果细胞为贴壁生长，须先去除培养基，使用PBS清洗后，加入适量的胰蛋白酶覆盖细胞，并在37°C的培养箱中孵育约2分钟。接着，添加等量的培养基终止消化作用，用移液枪轻柔吹打细胞，将其从表面冲洗下来，并转移至50mL Falcon管中。

3. 对于悬浮培养细胞，直接将所需体积的细胞转移至50mL Falcon管中。

4. 使用血细胞计数器确定细胞活力，冷冻细胞的活力应至少为75%。

5. 在室温下以300×g进行5分钟的离心。

6. 准备冷冻培养基（见表1）。即便有多种细胞系需要不同配方，通常最常见的为：在含有FBS的培养基中，使用90%胎牛血清和10%二甲基亚砜；在无血清培养基中，使用90%条件培养基和10%二甲基亚砜。

使用前将冷冻培养基混合均匀并加热至37°C，确保其包含有效的冷冻保护剂以防止冰晶对细胞膜及其成分的损害。

7. 除去上清液。

8. 向细胞中加入适量的冻存培养基，以达到所需的细胞密度，通常对于哺乳动物细胞，此浓度为1×10⁶/mL。注意，细胞在冻存液中不可超过10分钟。

9. 将1mL样品分装到冷冻管中，并紧闭盖子。

10. 将冷冻管转移至室温的冷冻盒，再放入-80°C的冰箱，确保冷冻盒外周加入异丙醇，使温度以每分钟1°C的速度均匀下降，避免形成对细胞有害的冰晶。

11. 约24小时后，从冷冻盒中取出冷冻管并转移至液氮中进行长期保存。理想情况下，细胞应尽快转移到液氮中，以维持细胞活力。若细胞长期保存在-80°C下，可能会影响其活性。

第2阶段：解冻冷冻细胞系

1. 从液氮储存器中取出冷冻管，迅速放入37°C水浴中，直至细胞解冻约80%（请勿在室温下解冻），该过程不应超过1分钟。

2. 使用移液器将冷冻管中的物质转移至预热至37°C的约10mL培养基的15mL Falcon管中。

3. 以300×g离心5分钟，弃去上清液，用适量的培养基重悬细胞沉淀。

4. 将细胞悬液转移至培养容器，随后转移至37°C的培养箱进行培养。

通过遵循以上步骤，您可以有效地进行细胞冻存和解冻，为进一步的生物医疗研究奠定基础。对于细胞存储的各个环节，918博天娱乐官网始终提供专业的支持和技术指导，助力您的研究取得成功。