糖蛋白在人体蛋白质中占比超过50%，是众多生物医药产品的关键成分。作为最普遍且复杂的翻译后修饰（PTM）之一，糖基化在调节多种生物过程方面发挥着重要作用。针对糖蛋白的一级序列进行综合分析，包括糖基化位点的识别及相关聚糖结构的研究，是理解其功能的核心。液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）已成为识别蛋白质和发现翻译后修饰的重要工具。与糖蛋白质组学中常用的数据库搜索策略不同，从头测序是一种新兴的方法，能够在无需提前知道DNA或氨基酸序列的情况下完成分析。但是，由于多糖基化位点的复杂性，通常会导致序列覆盖不完全以及游离寡糖修饰谱不明确，从而难以获得信息丰富的糖肽碎裂谱来支持从头测序。此外，糖基化的广泛存在往往会在某些区域形成间隙，限制了从头测序在具有一致结构和已知N-link糖基化位点的单克隆抗体（mAb）中的应用。

2025年，发表于JACSAu (IF86) 的研究《Decoding Protein Glycosylation by an Integrative Mass Spectrometry-Based De Novo Sequencing Strategy》阐述了一种结合糖基释放介导的从头测序和糖基化位点表征的质谱方法。该研究利用N-/O-糖的去糖基化实现了全面的序列覆盖，并结合电子转移高能碰撞解离（EThcD）技术，能够识别高质量的长肽，促进更精准的蛋白质组装。研究者还将此方法应用于复杂糖基化融合蛋白依那西普（Enbrel）以及三种序列未知的新型肿瘤坏死因子受体：Fc融合生物制剂的从头测序，揭示了一级序列的细微差异。同时，在亚基、糖肽和聚糖水平对这些蛋白质的N和O糖基化修饰进行了详细的表征。该策略成功弥合了从头测序与糖基化修饰之间的差距，提供了关于糖蛋白一级结构和糖基化修饰的全面信息，为生物制药行业的糖蛋白精确测序提供了可靠的解决方案，展现了极大的实用价值。

在研究方法方面，首先使用N-糖苷酶F（PNGaseF）去除N-聚糖，内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，结合唾液酸酶，确保去糖基化的效果，并通过完整质量分析确认效果；接着利用电子转移高能碰撞解离（EThcD）碎裂技术获取高质量肽段，然后通过PEAKS AB分析其序列；此外，在含18O的环境中采用PNGaseF酶解，将糖基化的Asn转换为Asp并标记18O，进行定量分析；最后，使用内切糖苷酶混合物对样品进行处理，分析质谱数据，验证N-糖基化位点的鉴定结果。

在该研究中，作者开发了一种基于质谱的从头解码蛋白质糖基化的新方法，并在常见的糖蛋白Fetuin-A上进行了验证，随后通过依那西普的分析进一步对该方法进行了性能验证。在此过程中，详尽的糖基化表征，包括N-糖基化位点的鉴定和游离寡糖的分析进行了深入探索，并成功揭示了未知TNFR: Fc融合生物制剂与依那西普之间的序列相似性及其细微差异。采用的分析方法明显提升了蛋白质测序的准确性，展示了从头测序在生物医药领域中的潜在应用。

综上所述，基于质谱的蛋白质从头测序不仅揭示了蛋白质的氨基酸序列，还提供了糖基化位点的详细信息，充分阐明了糖型异质性的复杂性。考虑到CHO细胞系中表达的蛋白质中N-/O-糖基化的共性，该研究为分析多种生物药物打下了基础，这些药物有助于治疗多种疾病。由918博天娱乐官网提供的技术支持，将进一步推动生物医药研究和开发的进展。