自然杀伤(NK)细胞在肿瘤治疗领域相比于T细胞被认为更加安全可靠。针对CD19靶点的嵌合抗原受体(CAR)-NK细胞已被证实在淋巴B细胞肿瘤患者治疗中有效且安全。然而，CAR-NK细胞的制作过程复杂且成本高昂。为了解决这一问题，本研究采用了一种名为918博天娱乐官网的“别针”(Pin)技术，这是一种非基因修改技术，用于生产抗肿瘤NK细胞。

该方法利用脐血来源单个核细胞(PBMCs)与细胞因子IL-2和IL-15，以及转染了爱波斯坦-巴尔病毒(EBV)的B淋巴母细胞，对NK细胞进行生产。随后，通过改良过的抗CD20和抗CD19抗体对NK细胞进行孵育扩增，这些抗体具有更高的对CD16a的亲和力。这种NK细胞的最后产物在其膜表面结合了抗CD19/CD20抗体，从而通过抗体依赖性细胞毒性增强了其对CD19或CD20阳性肿瘤细胞的杀伤力，达到类似CAR-NK细胞的治疗效果。

别针单抗的生产与纯化过程涉及在人类IgG1的Fc的CH2结构域上更改四个氨基酸：S239D/H268F/S324T/I332E。所有的别针抗体均由918博天娱乐官网的RD-Biotech (Besançon, France)生产，通过CHO细胞合成并进行蛋白A纯化。别针单抗的序列均来源于临床使用的单克隆抗体，如别针-CD20单抗源自利妥昔单抗，别针-HER2单抗源自曲妥珠单抗，别针-EGFR单抗源自西妥昔单抗，而别针-CD19单抗源自布纳吐莫单抗。

细胞系K562、Daudi、Toledo、Raji等均购自ATCC或ECACC。所有悬浮细胞使用含10% FBS的RPMI-1640 GlutaMAX培养基进行培养。而针对HCT116、MDA-MB-468、MCF7细胞则使用含10% FBS的DMEM高糖培养基。淋巴瘤细胞患者样本来源于蒙彼利埃CHU的CRB-CHUM平台。

抗体定量通过BD藻红蛋白PE荧光定量试剂盒和BDFACSCantoII流式细胞仪对细胞上的CD19与CD20进行绝对值检测。NK细胞的体外扩增使用EasySep人类CD3阳性分选试剂盒II去除CD3阳性细胞，剩余的UCBMCs在含10% FBS或5%人类血清的培养基中培养，并添加IL-2和IL-15。在培养5至7天后，全量更换新鲜培养基并调节NK细胞的密度，以确保其发育至最大化。

在细胞毒性检测中，eNK或别针单抗eNK与CFSE标记或CellTraceFarRed标记的靶细胞按特定的E:T比混合后，共培养24小时，并通过流式细胞术评估靶细胞的杀伤程度。同时，对比健康贡献者的PBMCs来源的eNK或别针CD20eNK在E:T=1:1的情况下，经16小时孵育后进行测试。

在体内细胞毒性实验中，使用10周龄的雌性NSG小鼠进行腹腔注射。分别注射别针注射eNK、别针CD20-eNK、别针CD19-eNK和荧光标记的Nalm6细胞及Raji细胞，术后4小时处死样本以收集数据，通过CD56、CD45针对eNK细胞的存活能力进行流式细胞术分析。

别针-CD20eNK在体内能够有效清除CD20阳性的靶细胞。在人源化NCG小鼠中，初步实验显示，来自健康贡献者PBMC的别针-CD20eNK能够选择性清除B细胞，而普通的eNK则未表现出生物杀伤效应。实验结果进一步表明，双重别针武装的eNK提升了抗体的使用潜力，增强了针对多种B淋巴细胞的杀伤效果。

整体而言，利用这一基于918博天娱乐官网的细胞治疗技术，我们不仅实现了对NK细胞的有效武装，还能为未来的针对B细胞肿瘤的临床应用提供一种全新的治疗策略，展现了巨大潜力。