IPS诱导肠类器官培养的过程可以划分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化与中/后肠模式化诱导，以及类器官的培养。本文主要聚焦于第二阶段——内胚层分化与中/后肠模式化诱导。

一、前期准备

1. 试剂与设备

在进行内胚层分化之前，需要准备以下试剂和设备：

• 细胞来源：H1/H9hESC或患者来源的iPSCs。
• 培养基：人多能干细胞培养基（abs9403）和RPMI1640（abs9484）。
• 消化液：人多能干细胞消化液（abs9409）。
• 培养基添加剂：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（2mM）（abs9295）和双抗（abs9244）。
• 生长因子：ActivinA（100ng/mL）（abs05801）、FGF4（500ng/mL）（abs06269）、WNT3a（500ng/mL）（abs05632）。
• 基质胶：即用型基质胶（abs9410）和类器官专用基质胶（abs9495）。
• 血清：透析胎牛血清（abs945）。
• 关键设备：表面培养皿、立体显微镜、无菌手术刀和预冷微量离心管。

2. 试剂配制

按照以下步骤制备内胚层分化培养基：

• Day 1：RPMI1640 + L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（2mM） + 双抗（1%） + ActivinA（100ng/mL）。
• Day 2：Day 1配方 + 透析胎牛血清（0.2%）。
• Day 3：Day 1配方 + 透析胎牛血清（2%）。

中/后肠分化培养基则为：RPMI1640 + 透析胎牛血清（2%） + FGF4（500ng/mL） + WNT3a（500ng/mL）。

二、hPSCs传代与铺板

1. 细胞传代（耗时2小时）

使用人多能干细胞消化液，消化hPSCs至边缘出现卷曲。用细胞刮刀轻柔剥离细胞团，重复吹打至1-2mm大小的细胞团，并按1:6的比例接种至Matrigel包被的24孔板中（每孔约5000个细胞团）。轻敲培养板以确保细胞均匀分布，然后在37°C下过夜培养。

2. 细胞扩增至85-90%融合（3-4天）

每日更换人多能干细胞培养基，并观察细胞密度。需注意，如果细胞密度过高（易出现自发分化）或过低（分化效率低），应重新铺板。

三、内胚层分化（3天）

分化过程

1. Day 1：吸除人多能干细胞培养基，加入Day 1内胚层培养基（无血清），培养24小时。
2. Day 2：更换为Day 2内胚层培养基（含0.2%透析胎牛血清），继续培养24小时。
3. Day 3：更换为Day 3内胚层培养基（含2%透析胎牛血清），再培养24小时。

（可选）可通过免疫染色检测FOXA2/SOX17双阳性细胞，以验证分化效率（应达到85-90%）。

四、中/后肠模式化（3-4天）

1. 诱导球状体形成

移除内胚层培养基，并加入中/后肠分化培养基，每日更换。经过48小时观察，若在立体显微镜下发现上皮增厚，72-96小时后应能看到球状体（spheroids）从单层细胞中脱离。

2. 收集球状体

使用200μL枪头收集游离的球状体，每管约50个，并将其置于冰上备用。

本期推荐的产品包括：

• 人多能干细胞培养基（abs9403）
• 人多能干细胞消化液（abs9409）
• L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（abs9295）
• 即用型基质胶（abs9410）

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